【客户项目】多组学分析揭示新发1型糖尿病儿童肠道菌群的功能和代谢变化

Part 1

导读

本研究基于独立队列综合分析了新发1型糖尿病(T1D)儿童的肠道微生物功能和代谢变化并研究了潜在机制,揭示了T1D中微生物功能和代谢特征的紊乱,为基于微生物组的T1D预防和干预提供了潜在途径。

 

Part 2

论文

原名:Functional and metabolic alterations of gut microbiota in children with new-onset type 1 diabetes

译名:新发1型糖尿病儿童肠道菌群的功能和代谢变化

期刊:Nature Communications

IF:17.694 (Q1)

发表时间:2022.10

通讯作者:Feihong Luo; Guang Ji

通讯作者单位:复旦大学儿童医院;上海中医药大学

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-022-33656-4

 

Part 3

实验设计

 

Part 4

实验结果

1.受试者一般资料

新发T1D和非糖尿病对照(NC)的儿童分别被纳入发现和验证队列,两组的年龄、性别、分娩方式和喂养方式相匹配。由于体重指数(BMI)较低,T1D组表现出血糖控制不佳和C肽水平低。T1D组的全身炎症参数水平,包括白细胞(WBC)计数和中性粒细胞(NEUT)计数显著增加,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著降低,甘油三酯(TG)水平升高。验证队列类似。

 
 
 

图1 研究参与者的特征

2.T1D肠道微生物群的结构调节

反映微生物群丰富性和多样性的Chao1和Shannon指数在T1D组显著下降。基于加权UniFrac距离度量的主坐标分析(PCoA)和置换多变量方差分析(PERMANOVA)显示两组之间的微生物群落结构存在显著差异。另外观察到T1D组的组成差异增加,表明T1D个体之间的群落结构比NC组更异质。在门水平,T1D组的厚壁菌门丰度显著降低,拟杆菌门和变形菌门丰度显著升高。在属水平,T1D组的厚壁菌门内许多产生丁酸盐的属包括FaecalibacteriumBlautiaLachnospiraRuminococcus 2Roseburia减少,BacteroidesParabacteroidesEscherichia Shigella等属扩增。在验证集中检测到类似的T1D微生物群谱。此外根据地理区域和疾病状态(是否经历过糖尿病酮症酸中毒(DKA))进行亚组分析,在发现和验证集中的整体细菌结构中没有发现显著差异。

通过随机森林分析,使用126个高度丰富的属构建了T1D的最佳分类模型。通过留一法交叉验证,选择了22个属作为提供最佳区分能力的关键属。这些关键属对T1D显示出适度的区分作用,发现和验证集的曲线下面积(AUC)分别为0.815和0.649。

使用宏基因组测序进一步分析了物种水平的微生物群落结构。网络分析显示,T1D组许多产丁酸盐的物种如Faecalibacterium prausnitziiEubacterium rectaleRoseburia gutis丰度降低,许多机会性致病菌包括Escherichia coliunclassified EnterobacteriaceaeKlebsiella pneumoniae在T1D组形成紧密的簇并富集。此外,由各组物种形成的网络在NC组中更相互关联。基于随机森林模型,选择了35个物种作为最能鉴别T1D的物种,这些细菌物种分为两个簇,簇1主要由产生丁酸盐的细菌组成,簇2主要由机会性致病菌组成。对临床指标与差异物种的Spearman相关性分析显示,血红蛋白A1c(HbA1c)、空腹血糖(FBG)和TG水平与簇1中的物种呈负相关,与簇2中的物种呈正相关,而HDL-C显示相反的模式。此外,代表全身炎症的指标,如WBC、NEUT和淋巴细胞(LYMPH)水平,与簇1中的许多物种呈负相关。代谢参数和关键物种之间的多重相关性表明肠道微生物群可能参与调节T1D的葡萄糖代谢、脂质代谢和炎症反应。

 
 
 

图2 T1D儿童肠道菌群的结构转变

3.T1D肠道菌群的功能改变

与NC组相比,T1D组显示出基因计数、Chao1和Shannon指数减少。基于物种的加权UniFrac距离的PCoA和PERMANOVA也显示出组间显著差异,T1D组的成分差异高于NC组。基于KEGG直系同源物(KO)的Bray-Curtis距离的PCoA和PERMANOVA表明两组之间在功能水平上存在显著差异。使用线性判别分析效应大小(LEfSe),在T1D组检测到27条上调和29条下调通路,其主要参与碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢。值得注意的是,T1D组的淀粉和蔗糖代谢水平较低,脂多糖(LPS)合成增加。

此外,T1D组编码碳水化合物活性酶(CAZy)的基因总丰度显著低于NC组。值得注意的是,差异表达最大的CAZy基因主要参与淀粉、糖原、蔗糖和果糖代谢,在T1D组均减少。以丁酸盐代谢为重点,基于有关丁酸盐产生途径的数据库进一步进行比对,发现T1D组涉及丁酸盐产生途径的大多数基因都被下调。然后构建了Faecalibacterium prausnitzii的基因组草图,发现该物种贡献了与丁酸代谢相关的基因总丰度的13.58%,NC组和T1D组所有基因总丰度的16.27%和10.35%。此外,T1D组中与LPS合成相关的基因总丰度显著增加,与编码微生物胆盐水解酶(BSHs)和胆汁酸代谢的基因总丰度显著降低。总体而言,宏基因组分析显示,T1D组的微生物功能特征受到干扰,包括LPS生物合成增加,丁酸盐产生、碳水化合物代谢和胆汁酸代谢减少。

 
 
 

图3 T1D儿童微生物功能的改变

4.T1D的异常代谢活动

为了进一步研究T1D中肠道微生物群的生物学效应,使用粪便样本进行了代谢组学分析。T1D组的L-焦谷氨酸、蝶呤、5-羟基色氨酸、N1-乙酰精胺和3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸水平显著升高,而21种代谢物包括葡糖去氧胆酸、甘鹅去氧胆酸和DL-苄基琥珀酸等显著减少。这些差异代谢物属于11种代谢途径,主要与胆汁酸、碳水化合物、核苷酸和氨基酸代谢有关。根据KEGG通路富集分析,三个通路显著富集:果糖和甘露糖、半乳糖和咖啡因代谢通路。另外还发现,T1D组的SCFA、丁酸盐和乙酸的总浓度显著低于NC组,胰高血糖素样肽1(GLP-1)的血清浓度低于NC组,其分泌可被丁酸盐刺激。T1D组的成纤维细胞生长因子19(FGF19)水平显著升高,它是肝胆汁酸合成的负反馈调节剂。此外,来源于肠道细菌的抗原负荷替代标志物LPS结合蛋白(LBP)的水平、由LPS刺激产生的促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)的水平在T1D组均显著升高。

粪便代谢物与临床参数之间的Spearman相关性分析显示,T1D组富集的代谢物(如蝶呤、N1-乙酰精胺和L-焦谷氨酸)的浓度与血清HbA1c、FBG和TG的水平呈显著正相关。此外,T1D组减少的代谢物如丁酸、乙酸和DL-苄基琥珀酸,与产丁酸盐的物种包括Faecalibacterium prausnitziiEubacterium rectaleRoseburia faecis呈正相关,但与机会致病菌呈负相关,然而在T1D组富集的代谢物(如蝶呤和L-焦谷氨酸)中观察到相反的模式。

使用关键细菌物种和粪便代谢物的组合构建了随机森林回归模型,以筛选与T1D相关的生物标志物。对关键的35种细菌和28种粪便代谢物的组合分析表明,一组9种细菌和9种粪便代谢物的组合提供了最好的区分能力。值得注意的是,与单独使用微生物组生物标志物相比,细菌种类和粪便代谢物的组合标志物在发现集和验证集中提供了很大改进。因此,组合分析可以优化T1D鉴别的准确性,并且组合生物标志物可以为制定基于微生物组的T1D预防和干预策略提供新的见解。

 
 
 

图4 T1D儿童的异常粪便代谢模式

5.T1D相关肠道菌群移植引起的葡萄糖稳态紊乱

为了评估肠道微生物群与T1D血糖控制恶化之间的因果关系,将肠道细菌从T1D儿童和健康儿童移植到抗生素治疗的小鼠中。在没有外部刺激的情况下,与对照组(FMT NC)相比,与T1D相关的小鼠受体(FMT T1D)显示出更高水平的空腹血糖。胰岛素耐受试验还显示,FMT T1D组在胰岛素激发30分钟后葡萄糖水平显著增加,这表明胰岛素敏感性降低。有趣的是,补充丁酸盐消除了不同肠道微生物群诱导的FBG水平差异,并显著改善了胰岛素抵抗(IR)。在口服糖耐力测试(OGTT),胰岛素和C肽水平,以及胰腺组织的组织学结构方面,两组之间没有发现差异。

进一步研究了肠道微生物群的差异是否可以通过FMT转移。基于Bray-Curtis距离的PCoA显示两组之间的肠道微生物群结构存在明显偏差,α多样性没有显著差异。FMT T1D小鼠的厚壁菌门/拟杆菌门比率降低,产生丁酸盐的粪菌的相对丰度降低。此外,由一些有益细菌组成的属如AkkermansiaMuribaculaceae norank在FMT T1D组降低。

检测toll-like受体4(TLR4)、MyD88和磷酸化核因子-kappaB(p-NF-κB)p65的肝脏表达以评估全身炎症反应。FMT T1D组TLR4和MyD88相对表达明显升高,同时p-NF-κB/NF-κB比值也升高,然而差异没有统计学意义,促炎细胞因子IL-1β的血清水平显著增加。这些数据表明,与T1D相关的肠道微生物群可以诱发炎症和糖尿病的早期症状。

 
 
 

图5 T1D相关肠道菌群移植引起的葡萄糖稳态紊乱

6.丁酸盐和LPS在链脲霉素(STZ)诱导的T1D小鼠中的作用

最后,在STZ诱导的T1D小鼠中探索了特定细菌代谢物丁酸盐和LPS的作用。丁酸盐的口服给药在T1D小鼠模型中发挥抗糖尿病作用,与未处理的T1D小鼠相比,FBG、OGTT和ITT中的葡萄糖水平和HbA1c值显著降低证明了这一点。值得注意的是,与模型组相比,丁酸盐处理组的血清C肽水平(T1D的关键诊断标准之一)显著升高,血清胰岛素水平也升高。相反,与模型组相比,LPS组在OGTT和ITT中的FBG和葡萄糖水平升高,血清C肽水平降低。

然后评估了胰岛功能。胰腺切片的苏木精-伊红染色和免疫组织化学分析表明,与T1D小鼠相比,丁酸盐治疗减轻了STZ诱导的胰岛损伤,胰岛和总胰岛素阳性胰岛的数量增加。与模型组相比,LPS处理组的胰岛数量较少,胰岛结构受损较多。在丁酸盐处理组中,促炎细胞因子IL-1β减少,而LPS显著增加IL-1β的分泌,这可能对胰岛结构和功能造成炎症损伤。总之,这些发现表明丁酸盐可减轻胰岛损伤并保留功能性β细胞,而LPS会进一步加重STZ诱导的糖尿病小鼠的胰岛损伤和功能障碍。

为了探索生物学过程和潜在机制,通过RNA测序转录组分析监测胰腺中对丁酸盐和LPS的转录反应。基于所有样本的胰腺基因表达谱,LPS处理组显示出与其他三组不同的谱。将四组中鉴定的625个差异表达基因(DEG)分为三个簇,簇1主要由与代谢途径相关的基因组成,在对照组和丁酸盐组中显著富集,簇2主要由与免疫和刺激反应相关的通路组成,与其余组相比,LPS组通路特异性上调,簇3主要由与生物过程相关的通路和信号通路组成,这些通路在模型组和LPS组中富集。

最后,使用成对比较来确定DEG。簇1主要关注关键的前胰岛素原编码基因胰岛素Ins1和Ins2。丁酸盐组Ins1和Ins2表达水平显著升高,LPS组低于模型组,与免疫组织化学分析结果一致。簇2NOD-like受体信号通路(Il1b、Il6、Il18和Caspase 1)和TLR信号通路(Tlr2、Tlr4和Tlr6)中的代表性基因与模型组相比,在LPS组中上调,但在丁酸盐组中下调。KEGG通路富集分析显示,与炎症和免疫反应相关的通路,包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号通路,在LPS组中主要上调,在丁酸盐组中下调。与胰岛素信号通路相关的通路,包括forkhead box O信号通路和内分泌抵抗,在丁酸盐组中显著下调。

 
 
 

图6 丁酸盐和LPS在STZ诱导的T1D小鼠中的作用

 

Part 5

结论

多组学分析和动物实验破译了肠道菌群失调的功能和代谢特征,并探索了T1D中肠道菌群与葡萄糖代谢失调之间的因果关系和潜在机制,主要发现有:(1)T1D相关肠道菌群失调的特点是LPS生物合成增加,丁酸盐产生和胆汁酸代谢减少;(2)9种细菌和9种粪便代谢物的组合产生了对新发T1D的出色鉴别能力;(3)人类T1D相关肠道菌群可诱导抗生素治疗小鼠的空腹血糖水平升高并降低胰岛素敏感性;(4)丁酸盐和LPS分别对T1D小鼠的葡萄糖代谢和胰岛结构和功能发挥保护作用和破坏作用。本研究扩展了对T1D微生物功能和代谢失调的见解,表明特定的肠道细菌和代谢物可以作为T1D的新型辅助诊断、预防和治疗靶点。

 

 

 

发布时间:2024-10-08 12:13